Spark^® Cyto

스파크 사이토는 실시간 세포 분석을 위한 고도로 정교한 형광 이미징 모듈이 장착된 멀티모드 리더 플랫폼입니다.

학습 - 선택 - 측정

프레딕티브 온콜로지는 신약 개발 과정의 초기 단계에서 인간의 다양성을 도입하는 솔루션을 제공하는 과학 중심 회사입니다. 이 회사는 유방 조직의 상태를 재현하고 상피 및 간질 틈새를 포함한 종양 미세 환경을 재현하기 위해 3D 배양 모델인 r-Breast를 개발했습니다. 이를 통해 신약 또는 약물 조합을 평가하는 데 생리학적 관련 접근 방식을 제공하는 동시에 세포 외 기질 구성의 종별 차이를 설명할 수 있습니다. 이 애플리케이션 노트에서는 유방 섬유아세포와 T세포를 사용한 두 가지 공동 배양 시스템에 대한 연구를 설명합니다. 첫째, 섬유아세포와 유방암 세포를 공배양하여 약물 감수성에 미치는 영향을 평가했습니다. 둘째, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 약물 치료가 T세포가 있는 상태에서 유방암 세포의 생존력에 미치는 영향을 조사했습니다. 요오드화 프로피듐 기반 분석과 CellTiter-Glo® 발광 분석(Promega)이 포함된 r-Breast 모델을 사용하여 세포 생존력을 평가하고, Spark Cyto 멀티모드 리더기를 사용하여 결과를 효율적으로 평가했습니다.

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)는 급속한 확산으로 인해 전 세계적인 우려가 되고 있습니다. 프랑크푸르트 대학에서 발표한 이 연구는 높은 처리량의 SARS-CoV-2 실험과 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하는 세포 감염 모델 개발을 위해 Spark Cyto를 사용한 방법을 설명합니다. 자동화된 비침습적 광학 판독에는 합류, 거칠기 계수 및 형광 측정 평가가 포함되었습니다. 이 데이터는 항바이러스 화합물 스크리닝과 다양한 SARS-CoV-2 변종에 대한 중화 항체의 효능을 조사하는 데 이 세포주를 사용하는 것을 더욱 강조합니다.

이 애플리케이션 노트는 Spark Cyto에서 반복 노출 및 연속 형광 이미징 동안 최소한의 세포 독성으로 살아있는 세포 핵 염색을 가능하게 하는 실험 파라미터와 SparkControl™ 및 Image Analyzer™ 소프트웨어를 사용한 강력한 자동 세포 세분화를 체계적으로 정의합니다.

이 최적화된 절차는 세포 사멸의 초기 및 후기 단계를 감지하고 구별하기 위해 멀티플렉스 3색 분석에 사용되어 역동적인 장기 표현형 추적의 문을 열었습니다.

알츠하이머병(AD)과 혈관성 치매(VaD)는 가장 흔한 두 가지 유형의 치매로, 그 발병률은 해마다 증가하고 있습니다. 노인의 건강에 영향을 미치고 사회에 큰 부담을 주며, 현재 효과적인 치료법이 없는 상태입니다.

시험관 연구는 약물 평가의 첫 번째 단계이며, 세포 면역 형광은 약물의 역할을 보다 명확하게 정의하고 후속 약물 개발을 위한 보다 포괄적이고 정확한 정보를 제공하는 데 사용될 수 있습니다.

이 연구에서는 세포 이미징 기능을 갖춘 혁신적인 멀티모드 리더기인 Spark Cyto를 사용하여 안정적으로 형질전환된 세포주와 인간 원시 뉴런에 대한 miR-23b-3p(miRNA)와 틸리아닌(화합물)의 신경 보호 효과를 평가했습니다. 이 애플리케이션 노트의 결과는 2021년 8월 산화 의학 및 세포 수명 저널에 게재된 동료 심사를 거친 논문을 기반으로 하며, 제목은 다음과 같습니다: 틸리아닌은 혈관성 치매를 앓는 쥐의 인지 기능 장애와 신경 손상을 p-CaMKII/ERK/CREB 및 ox-CaMKII 의존성 MAPK/NF-κB 경로를 통해 개선합니다.

과학적 혁신은 관찰의 힘과 그 관찰에서 도출된 결론의 힘에 달려 있습니다. 체외 생물학에서 생리적으로 관련된 대부분의 결과는 용량 및 노출 의존적 요인을 따릅니다. 안타깝게도 기존 세포 기반 실험의 데이터 수집은 종종 임의적이지만 편리한 엔드포인트에서 이루어지며, 부적절하거나 정보가 부족한 도구를 사용합니다. 그 결과 데이터는 일반적으로 인과 관계의 세부 사항을 완전히 설명하기에 적절한 운동학적 해상도가 부족합니다. 생물학적 경로와 과정은 이미 본질적으로 복잡하기 때문에 과학자들이 주어진 반응을 더 잘 특성화하기 위해 '언제'와 '어떻게'라는 중요한 매개변수를 조사할 수 있는 보다 효율적인 스크리닝 패러다임이 필요합니다. 이 애플리케이션 노트는 실시간 분석과 명시야 및 형광 이미징 기능을 갖춘 플레이트 리더기가 어떻게 함께 작동하여 세포 및 화합물 특이적인 세포 사멸 반응의 특징을 밝혀낼 수 있는지에 대한 실질적인 데모를 제공하고자 합니다.

이 애플리케이션 노트에서는 세포 사멸 세포 검출을 위해 오페라 페닉스와 스파크 사이토를 비교한 실험의 결과를 설명합니다. 이 연구에서는 Hoechst 33342를 '파란색' 핵 카운터 염색으로 사용했으며, 두 개의 보조 마스크 신호로 TMRM과 YO-PRO-1을 사용했습니다. 여기에 제시된 결과가 두 시스템 간의 일반적인 성능 차이를 반드시 반영하는 것은 아닙니다.

스파크 사이토 멀티모드 리더를 통한 워크플로 자동화.

온도 변화에 따른 골형성 분화 유도 후 hfob.1.19 세포의 리포터 활동 자동 모니터링

3D 배양은 생리적 조직 조직과 임상 결과의 강력한 예측 측면에서 2D 배양 접근법보다 우수하지만, 이러한 기술은 표준 2D 프로토콜에 비해 수행에 더 많은 비용과 시간이 소요되는 경우가 많습니다. 따라서 각 실험에서 최대한 많은 정보를 얻으려면 다양한 판독값을 사용하여 다중 분석을 수행하는 것이 유용합니다. 여기에서는 순차적 이미징 기반 라이브/사멸 세포 생존율 분석(Thermo Fisher Scientific)과 Tecan Spark Cyto를 사용한 CellTiter Glo 발광 분석(Promega)을 r-Breast 및 r-mBreast 모델과 결합하는 멀티플렉스 접근 방식에 대해 설명합니다.

The genomic integrity of mammalian cells is constantly challenged by DNA damage arising from both endogenous and exogenous sources. Complex DNA repair pathways have evolved to deal with specific types of DNA lesions. An efficient DNA damage response (DDR) requires immediate detection and repair of the damage.

In addition, cell cycle checkpoints need to be activated to allow enough time for repair, prevent further damage through collision of the replication and transcription machinery with unrepaired lesions, and ensure that lesions are not passed on to daughter cells.

While impaired DDR can lead to serious diseases like cancer, it also presents an opportunity for therapeutic interventions exploiting these repair defects. 1 DNA repair is a highly dynamic process involving distinct and well-coordinated steps, and should therefore ideally be studied in living cells.2 However, a lot of post-translational modifications essential for the DDR can only be analyzed in fixed cells.

Highly aggressive cutaneous squamous cell carcinomas (SCCs) occur particularly frequently and early in patients suffering from the rare genetic skin disease recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB), causing a high mortality rate...

Predictive Oncology’s r-Tube 3D model mimics the niches in which endothelial cells reside within tissues, providing a more physiologically accurate platform. This allows the effectiveness of novel drugs or drug combinations to be evaluated in a setting that captures the species-specific differences in ECM composition. In this manner, the r-Tube 3D system offers a valuable tool for studying cancer and contributing to the development of improved therapeutic strategies, by incorporating the microenvironment into the culture model. The Spark Cyto has been widely used for bright field and fluorescence imaging in 3D models and has proven suitable for imaging thick samples with cells embedded in a 3D matrix. A multiplex approach using the r-Tube 3D model to investigate eribulin and ramucirumab treatment was therefore performed using the Spark® Cyto with sequential bright field imaging and CellTiter- Glo® luminescence analysis (Promega).

The essence of 3D liver tissue reconstruction lies in creating functional liver tissue outside of the body, mimicking the native ECM and microenvironment. This approach offers several advantages. First, it enables the study of liver pathophysiology and disease mechanisms, leading to better understanding of novel therapeutic targets. From a regenerative medicine standpoint, 3D liver tissue reconstruction offers patient-specific solutions; patient-derived tissues can be created using primary liver cells, minimizing the risk of immune rejection and eliminating the reliance on donor organs. These engineered liver tissues hold great promise for transplantation and tailored treatment plans. Furthermore, 3D liver tissue models provide an ethical and clinically relevant platform for drug testing, reducing the need for animal testing. This application note describes the combination of Tecan’s Spark Cyto reader with Predictive Oncology’s r-liver-tox set-up to perform multiplexing investigations, including live/dead cell analysis, detection of intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and the immunostaining of primary human hepatocytes.

Predictive Oncology has developed a three-dimensional (3D) model called the Reconstructed Pancreas (r-Pancreas), which attempts to replicate the pancreatic tumor microenvironment. It successfully recreates the conditions found in pancreatic tissue – including both the epithelial and stromal niches – offering a more physiologically relevant approach to assess new drugs, or combinations of drugs. As described in this Application note, this research model was used in combination with the Spark Cyto multimode reader to investigate the efficacy of gemcitabine, a therapeutic agent against pancreatic tumor cells. To enhance the physiological relevance of the r-Pancreas model, a collagen-rich capsule was introduced, as human pancreatic tumors are known to possess an outer layer of stiff ECM, acting as a physical barrier that hinders drug penetration. Moreover, by incorporating a co-culture of primary activated pancreatic stromal cells and pancreatic tumor cell lines, it was possible to create a more comprehensive 3D model that allows testing of potential therapeutic agents within the pancreatic tumor microenvironment. In this model, pancreatic tumor cells were co-cultured with human pancreatic fibroblasts.

Streamlining 3D cell culture-based drug response profiling with the Fluent® Automation Workstation, D300 Digital Dispenser, and Spark® Cyto multimode reader.

The development of treatments for snake bite induced vascular toxicity relies on robust, quantitative, and relevant in vitro models of blood vessels. Organ-on-a-chip is an emerging technology that uses miniaturized components to create a three-dimensional culture of human cells grown in a microfluidic system. In contrast to cells grown in 2D, blood vessels grown in microfluidic channels enable the inclusion of several important physiological parameters during cell culture, such as 3D tubular morphology, fluid perfusion, inclusion of extracellular matrix (ECM) and exposure to biochemical gradients. Real-time assays combining organ-on-a-chip platforms with multimode readers would enable direct monitoring of vascular barriers, viability and morphology with a sufficient temporal resolution to capture the fast effects of potent snake venom toxins. This application note describes the use of the Spark Cyto to multiplex readouts and comprehensively assess the potential of different snake venoms to cause vascular toxicity of a human blood vessel model grown in an organ-on-a-chip platform.

Patient-derived organoids (PDOs) are in vitro models originating from normal or cancerous stem cells that preserve the original cellular complexity, tissue morphology and pathophysiology. Currently, working with PDOs can be challenging due to the lack of automated equipment suitable for performing high throughput, imaging-based drug screening in organoid analysis pipelines. Tecan is addressing this need with a deep learning-based algorithm for the Spark® Cyto multimode plate reader, allowing automatic identification and segmentation of objects with complex 3D structures, such as organoids or spheroids. This application note evaluates the Spark Cyto for automated PDO imaging and analysis, using the new 3Dai deep learning-based algorithm available in the SparkControl™ software, as well as optimization of settings and re-analysis of the images in the Image Analyzer™ software.

세포 기반 분석을 사용하여 용량-반응 관계를 분석하는 것은 약물의 효능을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 적절한 용량 범위와 시점을 고정하는 것은 종종 어려운 일입니다. D300e 디지털 디스펜서는 단 몇 분 만에 0.2nm에서 1μM에 이르는 넓은 용량 범위에서 피코리터 단위로 화합물을 정확하게 전달할 수 있습니다. 이를 Spark Cyto 멀티모드 리더기의 라이브 세포 이미징 및 전체 세포 배양 기능과 결합하여 표준 배양 조건(37ºC, 5% CO2)에서 세포 증식을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술 노트에서는 발광 기반 및 명시야 이미징 기술을 동시에 사용하여 25개 시점에 9번의 투여로 세포 생존율을 추적하면서 항암제의 효능 프로파일을 종합적으로 캡처하기 위해 D300e와 Spark Cyto를 사용합니다.

이 기술 노트에서는 형광 이미지의 객체 분할 및 카운팅뿐만 아니라 밝은 필드 이미지의 합류 평가 최적화를 위해 Image Analyzer를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

이 애플리케이션 노트에서는 스파크 사이토의 다색 형광 이미징과 Image Analyzer™ 소프트웨어의 통합 보로노이 분석 기능을 사용하여 세포 내 Ca2+ 및 세포 내 Ca2+ 흡수를 분석하기 위한 준고처리량 접근법에 대해 설명합니다. 칼슘 이오노포어 이오노마이신으로 처리하여 세포 내 Ca2+ 농도를 증가시켰으며, 측정 정량화를 위해 Fluo-4를 핵 카운터스타인 Hoechst 33342와 함께 사용했습니다.

이 기술 노트에서는 세포 신호를 웰당 세포 수 또는 세포 질량으로 정규화하는 Spark Cyto의 기능에 대해 설명합니다. 이는 각 세포 기반 분석의 전반적인 데이터 품질을 극적으로 개선하고, 결과적으로 세포 기반 실험의 재현성을 개선하고 실험실의 효율성을 높입니다.

스파크 사이토를 사용한 형광 이미징 - 스파크콘트롤™을 사용한 빠른 획득

명시야 및 형광 이미징을 사용한 정확하고 자동화된 세포 밀도 평가...

마이크로 플레이트에서 단백질 발현의 시각화 및 정량화 자동화...

생존 세포, 세포 사멸 세포, 괴사 세포를 구별합니다.

생명의 정량화: Spark Cyto 이미징 세포 분석기로 죽은 세포 비율 감소.

SparkControl™은 사전 정의된 다양한 플레이트 정의 파일(.pdfx)을 제공하며, 자동 초점 오류를 방지하려면 이미징 애플리케이션에 올바른 플레이트 정의를 사용하는 것이 중요합니다. 또는 플레이트 지오메트리 편집기를 사용하여 목록에 없는 플레이트 형식에 맞게 기존 파일을 수정할 수도 있습니다.

이 기술 노트에서는 SparkControl™에서 플레이트 지오메트리 편집기의 사용법을 설명하고 pdfx 파일을 성공적으로 생성하기 위한 가장 중요한 측면을 짚어봅니다.

A non-invasive way to accurately count cells in brightfield using a deep learning algorithm.

Cell line development plays a crucial role in modern biological research and drug development. Clonal lines derived from a single cell can provide a reproducible and stable platform for drug discovery, studying biological processes and producing recombinant proteins. Genetic engineering and genome editing techniques have enabled the creation of cell lines with specific mutations or gene knockouts, allowing researchers to investigate the function of individual genes and pathways. Additionally, cell lines are used in the production of biologics, such as monoclonal antibodies and recombinant proteins, making the development of new and improved cell lines a critical area of research in both academia and industry. This technical note describes a method for using the Spark Cyto multimode reader to perform whole-well imaging of single mammalian cell clones in 96-well plates, in order to identify optimal clones. Both the Spark and Spark Cyto are capable of verifying monoclonality, however the Spark Cyto offers a faster readout and improved image quality compared to the Spark’s basic imaging functionality, providing higher throughput clone identification.

This technical note describes the use of the Uno Single Cell Dispenser to isolate single cells. This instrument harnesses microfluidic digital dispensing technology to gently isolate viable cells for various downstream applications, including cell line development.

The viability of the single cell post dispensing was assessed by addition of a fluorescent dye, that bound to the DNA of cells with impaired membrane integrity, using whole-well fluorescence imaging functions of the Spark Cyto.

Cell outgrowth rate was determined 10 days after single cell isolation with the Uno, using whole-well brightfield imaging. Using Uno and Spark Cyto together, enables simple single cell isolation and determination of monoclonal cell outgrowth for variety of downstream application.

Recent advancements in cell-based research strategies have revolutionized drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and personalized medicine. The shift from traditional 2D monolayer culture to three-dimensional (3D) cell culture systems has opened new avenues for more realistic representation of complex tissues within the human body. Particularly the use of multicellular 3D spheroids is showcased here. These spheroids represent a significant advancement in cell-based assays. In this note, the generation of spheroids in Corning 96-well, round bottom ULA microplates and subsequent monitoring and analysis of spheroid growth using the Spark Cyto multimode reader is presented. The integration of a plate washer (HydroSpeed™) further optimized the workflow, enhancing automation, standardization, and reproducibility, while reducing human errors. These advancements represent a substantial step forward in enhancing our understanding of cellular behaviors and developing more realistic in vitro models for various applications.

Traditional two-dimensional (2D) cell culture models, wherein cells are cultivated on planar and rigid substrates, exhibit limitations in predicting clinical trial outcomes due to the disparity in cellular behavior compared to in vivo conditions. In contrast, three-dimensional (3D) cell culture models, such as tumor spheroids and organoids, have gained prominence as they more accurately mimic the tumor microenvironment, thereby providing enhanced predictive validity for drug response and activity. However, the increased physiological relevance of these 3D models introduces challenges related to experimental and technical complexity. This technical note delineates the workflow for generating multiple spheroids embedded within a Matrigel matrix and discusses the application of z-stack imaging coupled with artificial intelligence (AI)-based automated analysis for the segmentation and evaluation of spheroids in the brightfield channel.

실험실에 시간 및 비용 이점 제공...

세포 기반 분석은 과학 연구 분야에서 다양하게 실용적으로 사용되고 있으며, 암 연구를 위한 종양 내성 테스트부터 신약 개발의 새로운 치료 화합물 식별에 이르기까지 많은 과학자의 워크플로에 필수적인 요소입니다.